香港大学张彤教授团队在Critical Reviews in Environmental Science and Technology（CREST，《环境科技评论》）期刊发表题为“培养活性污泥中尚未被培养的微生物（Culturing the uncultured microbial majority in activated sludge: A critical review; DOI: 10.1080/10643389.2022.2077063; Published online: 26 May 2022）”的特邀综述。
活性污泥工艺是一种被广泛应用的利用微生物去除污染物的废水处理方法。活性污泥中包含大量的功能性微生物，具有丰富的微生物多样性，是宝贵的微生物资源库。然而，其中的绝大部分微生物还没有被培养分离，这大大限制了污水处理效率的提高和工艺技术的创新。这篇综述总结了活性污泥中待培养的微生物名单，归纳了新型的微生物培养及检测方法，并讨论了对活性污泥中的未被培养的微生物群进行大规模培养的意义和前景。
图1 图文摘要（Graphical abstract）
全球调查显示，活性污泥体系拥有丰富的生物量，大约含有4~6×1023个细菌，且其中的大多数细菌还没有在实验室分离到纯培养物。这中间的一些重要的微生物物种应作为优先培养目标来探索纯培养的方法。这篇综述指出应该从四个方面来制定这个”优先名单“，即普遍性、丰富性、功能性和新颖性（表1）。名单中的这些细菌有的是在活性污泥系统中广泛存在的，有的是在活性污泥群落中丰度较高的，有些是能发挥重要的污染去除作用的（如脱氮除磷），有的则是在已培养菌群名单中还缺少相关代表的类型。在以后的研究中，应该使用更多的分析工具（如网络和相关性分析）评估微生物在活性污泥群落中潜在的生态作用，从而得到更全面的”优先名单“。同时，活性污泥中的其他重要群体也有待挖掘，如古菌、病毒、真菌、微藻等。
富集或预培养对微生物的分离培养是十分必要的，这有助于挖掘一些低丰度的新类群。综述中特别指出的一点是，如果要培养的目标微生物在某一微生物群落（不一定是活性污泥）中的丰度很高，则该微生物群落的样品可以直接作为分离培养的起点从而避免冗长的富集过程。综述中总结现阶段的微生物培养方法，认为可以大致分为四类（图2）。一是传统培养方法，主要是尝试利用各种选择压力或筛选条件（如抗生素和重金属等抑制剂、温度、pH、和细胞尺寸）在原始群落中“淘汰优势物种”从而促进难培养微生物的生长并最终获得纯培养物。二是原位培养方法，是将微生物初步分离后再放置在原位的生长环境中从而跳过复杂的培养基选择和优化过程，充分利用原位的培养条件。三是根据基因组草图进行预测基础上的培养方法，研究人员首先通过获得的目标微生物的基因组预测其代谢特点和机制偏好，再提供相应的营养物质和富集条件以促进目标微生物的优先生长，从而实现靶向培养。四是以微流控系统和流式细胞仪等分选技术为基础的培养方法，可以有针对性地、高效地、高通量地筛选目标微生物（尤其是功能性微生物和低丰度微生物），以便进一步富集和扩大培养。
图2现阶段的培养方法总结：a）传统培养；b）原位培养；c）以基因组预测为基础的培养；d）以细胞分选为基础的培养
与此同时，快速的群落和菌种鉴定方法对高效的微生物富集和培养是不可或缺的，它可以及时地提供群落的动态信息帮助实时地掌握和调整富集方向。16S rRNA基因是被广泛应用的物种标记基因（图3），它的检测方法包括Sanger测序法（全长16S rRNA基因），以二代测序为基础的Illumina测序法（16S rRNA基因片段），以及近年兴起的长读长测序（第三代测序）技术（全长16S rRNA基因，以Pacific
Biosciences和Oxford Nanopore Technologies为代表）。除以上的鉴定方法外，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometry, MALDI-TOF MS）可以通过微生物独特的蛋白质指纹和代谢物对纯培养物进行快速及高通量的鉴定、表征和分型。它的应用极大地促进了微生物分离培养的研究进度。总结来说，这些菌种和群落鉴定方法在成本、周转时间等方面各有特点，研究人员要根据自身的实验条件进行选择。除以上提及的方法外，荧光原位杂交（FISH）和实时定量PCR等也可以做为快速检测手段对目标微生物进行跟踪。
图3 a）Sanger全长16S rRNA基因测序；b）Illumina
16S rRNA基因片段测序；c）Pacific
Biosciences全长16S rRNA基因测序；d）Oxford Nanopore Technologies全长16S rRNA基因测序；e）MALDI-TOF MS
近年来一些高通量和创新的培养技术的快速发展为未被培养微生物的分离和培养带来了希望。这些方法在其他生态系统已经有了一些成功的应用案例，应尽快利用这些方法对活性污泥中未被培养的微生物进行大规模培养，这将有助于：①促进微生物群落研究的方法学的发展；②规范和优化活性污泥中微生物的培养流程；③扩大活性污泥中可被培养微生物的比例；④挖掘活性污泥中的新型功能微生物；⑤完善微生物的种群分类。
张玉琳，香港大学土木工程系环境工程微生物组和技术实验室在读博士生。研究方向是活性污泥中的功能微生物菌群的基因组分析，以及利用三代纳米孔测序对菌群进行快速准确鉴定及绝对定量。张彤，香港大学土木工程系讲座教授（环境工程）。课题组主要利用高通量多组学测序技术研究环境微生物组，为解析微生物生态功能，推动生物治理技术在污水处理方面的应用，以及建立环境污染的健康风险管控提供新视野。课题组在环境微生物组和抗生素抗性基因的环境维度等方面的长期研究取得了一系列重要成果，自主研发的耐药基因在线分析平台访问量接近3万次。近两年来，课题组在污水流行病学方面取得重要进展，构建了香港污水监测新冠病毒辅助抗疫的技术体系，取得了良好的社会效益和影响。发表300多篇学术论文、4项专利、谷歌学术总引用超过30000次、H指数96 (源自谷歌学术)。连续4年全球高被引科学家：2018
(跨领域)，2019 (环境与生态)，2020 和2021（环境与生态；微生物学）。担任《Microbiome》资深编辑。曾获国家自然科学二等奖，教育部自然科学一等奖，香港大学杰出研究学者奖、杰出研究生导师奖和创新者奖，日內瓦国际发明展金奖等奖项。